Ein Spektrophotometer ist eines der in vielen Forschungs- und Industrielabors üblichen wissenschaftlichen Instrumente. Spektralphotometer werden für die Forschung in Laboratorien für Physik, Molekularbiologie, Chemie und Biochemie eingesetzt. Typischerweise bezieht sich der Name auf Ultraviolett-Vis-Spektroskopie (UV-Vis-Spektroskopie).
Die Energie des Lichts hängt von seiner Wellenlänge ab, die üblicherweise als Lambda bezeichnet wird. Obwohl sich das elektromagnetische Spektrum über einen enormen Wellenlängenbereich erstreckt, können die meisten Laboratorien nur einen kleinen Bruchteil davon messen. Die UV-Vis-Spektroskopie misst bei UV-Lichtmessungen zwischen 200 und 400 Nanometer (nm) und im sichtbaren Spektrum bis zu etwa 750 nm.
Bei der UV-Vis-Spektroskopie werden Proben normalerweise in kleinen Behältern, sogenannten Küvetten, aufbewahrt und gemessen. Bei Verwendung im sichtbaren Bereich kann es sich um Kunststoff handeln, bei Verwendung für UV-Messungen muss es sich jedoch um Quarz oder Quarzglas handeln. Es gibt einige Maschinen, die Reagenzgläser verwenden können.
Die sichtbare Spektroskopie wird häufig industriell für die Farbmetrik eingesetzt. Mit dieser Methode werden Proben bei mehreren Wellenlängen von 400 bis 700 nm gemessen und ihre Absorptionsprofile mit einem Standard verglichen. Diese Technik wird häufig von Textil- und Tintenherstellern eingesetzt. Andere kommerzielle Anwender der UV-Vis-Spektroskopie sind forensische Labors und Drucker.
In der biologischen und chemischen Forschung werden Lösungen häufig durch Messung ihres Lichtabsorptionsgrades bei einer bestimmten Wellenlänge quantifiziert. Ein Wert, der als Extinktionskoeffizient bezeichnet wird, wird zur Berechnung der Konzentration der Verbindung verwendet. Molekularbiologische Laboratorien verwenden beispielsweise Spektrophotometer, um die Konzentrationen von DNA- oder RNA-Proben zu messen. Sie haben manchmal ein fortschrittliches Gerät namens NanoDrop ™ -Spektrophotometer, das einen Bruchteil der Probenmenge verwendet, verglichen mit der Menge, die von herkömmlichen Spektrophotometern verwendet wird.
Damit die Quantifizierung gültig ist, muss die Probe dem Beer-Lambert-Gesetz entsprechen. Dies erfordert, dass die Absorption direkt proportional zur Weglänge der Küvette und zur Absorption der Verbindung ist. Es gibt Tabellen mit Extinktionskoeffizienten für viele, aber nicht alle Verbindungen.
Viele chemische und enzymatische Reaktionen ändern mit der Zeit ihre Farbe, und Spektrophotometer sind sehr nützlich, um diese Änderungen zu messen. Beispielsweise oxidieren die Polyphenoloxidaseenzyme, die bewirken, dass Früchte braun werden, Lösungen von Phenolverbindungen und verwandeln klare Lösungen in Lösungen, die sichtbar gefärbt sind. Solche Reaktionen können durch Messen der Zunahme der Extinktion bei Farbveränderungen untersucht werden. Im Idealfall ist die Änderungsrate linear, und aus diesen Daten können Raten berechnet werden. Ein weiterentwickeltes Spektrophotometer verfügt über einen temperaturgesteuerten Küvettenhalter, um die Reaktionen bei einer genauen Temperatur durchzuführen, die für das Enzym ideal ist.
Mikrobiologische und molekularbiologische Labors verwenden häufig ein Spektrophotometer, um das Wachstum von Bakterienkulturen zu messen. DNA-Klonierungsexperimente werden häufig in Bakterien durchgeführt, und die Forscher müssen das Wachstumsstadium der Kultur messen, um zu wissen, wann bestimmte Verfahren durchzuführen sind. Sie messen die Extinktion, die als optische Dichte (OD) bekannt ist, auf einem Spektrophotometer. Man kann an der OD erkennen, ob sich die Bakterien aktiv teilen oder ob sie zu sterben beginnen.
Spektralphotometer verwenden eine Lichtquelle, um eine Reihe von Wellenlängen durch einen Monochromator zu strahlen. Diese Vorrichtung lässt dann ein schmales Lichtband durch, und das Spektrophotometer vergleicht die durch die Probe gehende Lichtintensität mit der durch eine Referenzverbindung gehenden Lichtintensität. Wenn zum Beispiel eine Verbindung in Ethanol gelöst wird, wäre die Referenz Ethanol. Das Ergebnis wird als Extinktionsgrad der Differenz zwischen ihnen angezeigt. Dies zeigt die Extinktion der Probenverbindung an.
Der Grund für diese Absorption ist, dass sowohl ultraviolettes als auch sichtbares Licht genug Energie hat, um die Chemikalien auf ein höheres Energieniveau anzuregen. Diese Anregung führt zu einer höheren Wellenlänge, die sichtbar wird, wenn die Extinktion gegen die Wellenlänge aufgetragen wird. Verschiedene Moleküle oder anorganische Verbindungen absorbieren Energie bei verschiedenen Wellenlängen. Diejenigen mit maximaler Absorption im sichtbaren Bereich werden vom menschlichen Auge als gefärbt angesehen.
Lösungen von Verbindungen können klar sein, aber im UV-Bereich absorbieren. Solche Verbindungen weisen üblicherweise Doppelbindungen oder aromatische Ringe auf. Manchmal gibt es einen oder mehrere nachweisbare Peaks, wenn der Absorptionsgrad gegen die Wellenlänge aufgetragen wird. In diesem Fall kann dies bei der Identifizierung einiger Verbindungen helfen, indem die Form des Diagramms mit derjenigen bekannter Referenzdiagramme verglichen wird.
Es gibt zwei Arten von UV-Vis-Spektrophotometern: Einstrahl- und Zweistrahl-Spektrophotometer. Diese unterscheiden sich darin, wie sie die Lichtintensität zwischen Referenz und Prüfling messen. Zweistrahlmaschinen messen gleichzeitig die Referenz- und Testverbindung, während Einstrahlmaschinen vor und nach der Zugabe der Testverbindung messen.